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抽象的

細(xì)胞壁完整性通路在細(xì)胞壁脅迫（CWS）下被激活。曲霉的防御系統(tǒng)利用三種轉(zhuǎn)錄因子——RlmA、MsnA 和 CrzA——它們也促進(jìn)對(duì)各種非生物脅迫的適應(yīng)，并涉及胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)組成和膜脂譜的改變。然而，它們?cè)谶m應(yīng)細(xì)胞壁脅迫中的作用尚不清楚。在黑曲霉中，剛果紅和鈣熒光白誘導(dǎo)的細(xì)胞壁脅迫導(dǎo)致頂端生長(zhǎng)明顯停止，并伴有菌絲球狀膨脹以及細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和葡聚糖含量的增加。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要由低水平的甘油和甘露醇組成，在細(xì)胞壁脅迫下甘油水平降低。細(xì)胞壁脅迫后，膜脂和儲(chǔ)存脂的組成和含量均未發(fā)生變化；然而，由于亞麻酸比例升高，磷脂的不飽和度增加，這可能增強(qiáng)了膜的流動(dòng)性。膜脂和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的這些微小重排并不能證實(shí)它們參與了剛果紅和鈣熒光白誘導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞壁損傷的適應(yīng)，這與之前基于細(xì)胞壁完整性途徑研究的假設(shè)相反。

關(guān)鍵詞：

細(xì)胞壁應(yīng)激；剛果紅；鈣熒光白；磷脂酸；多元醇；幾丁質(zhì)；葡聚糖

1. 引言

細(xì)胞壁（CW）維持細(xì)胞的形狀和完整性，是細(xì)胞包膜的一部分，與質(zhì)膜一起構(gòu)成抵御各種不利環(huán)境條件的第一道防線[ 1 ]。真菌細(xì)胞壁是一種動(dòng)態(tài)的多功能結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)生物和非生物相互作用。它能抵抗?jié)B透壓和機(jī)械應(yīng)力，并維持細(xì)胞形態(tài)[ 2 ]。此外，它還是多種酶的結(jié)合位點(diǎn)，并作為表面蛋白和糖蛋白的基質(zhì)，這些蛋白和糖蛋白參與識(shí)別、黏附和有性生殖[ 3 ]。細(xì)胞壁的重塑貫穿整個(gè)生命周期，并響應(yīng)脅迫、營(yíng)養(yǎng)缺乏、損傷以及互利共生或寄生關(guān)系的建立[ 2 ]。

與酵母不同，絲狀真菌的細(xì)胞壁由多種葡聚糖（β-1,3-葡聚糖、β-1,3/β-1,4-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖和α-1,3-葡聚糖）、幾丁質(zhì)和殼聚糖、甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖以及糖蛋白組成[ 4 ]。葡聚糖和幾丁質(zhì)由與其相關(guān)的合成酶在質(zhì)膜上合成，形成線性聚合物。真菌細(xì)胞壁的主要成分是β-1,3-葡聚糖，其重量占細(xì)胞壁的30-80%。β-1,3-葡聚糖不形成微纖維；它是一種具有β-1,6分支的支鏈聚合物，呈三螺旋結(jié)構(gòu)，并作為蛋白質(zhì)附著的基質(zhì)[ 5 ]。然而，線性α-1,3-葡聚糖能夠形成微纖維[ 6 ]。幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通過(guò)β-1,4糖苷鍵形成的線性均聚物。真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的比例從2%（酵母）到30%（絲狀真菌）不等。細(xì)胞壁區(qū)域內(nèi)反平行的幾丁質(zhì)鏈之間形成大量的氫鍵，從而形成微纖維或棒狀結(jié)構(gòu)[ 5 ]。幾丁質(zhì)的剛性源于其線性反平行的鏈結(jié)構(gòu)，使其成為自然界中最強(qiáng)的生物聚合物之一。幾丁質(zhì)以微纖維的形式定位于細(xì)胞壁內(nèi)層，并與柔性β-1,3-葡聚糖鏈共價(jià)結(jié)合。糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中合成，并通過(guò)分泌進(jìn)入細(xì)胞壁區(qū)域。此外，在交聯(lián)轉(zhuǎn)糖苷酶和糖苷水解酶的作用下，葡聚糖、幾丁質(zhì)和糖蛋白共價(jià)結(jié)合，形成細(xì)胞壁的三維結(jié)構(gòu)。剛性部分與柔性區(qū)域交錯(cuò)排列似乎是真菌細(xì)胞壁的一個(gè)共同特征，盡管其化學(xué)組成可能有所不同。例如，在煙曲霉中，幾丁質(zhì)與α-1,3-葡聚糖緊密堆積，形成由動(dòng)態(tài)β-1,3-葡聚糖連接的剛性片段[ 7 ]。其他多糖（半乳甘露聚糖、半乳糖胺半乳聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖）通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷酶與幾丁質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物共價(jià)結(jié)合[ 8 ]。

在真菌的生命周期中，細(xì)胞壁應(yīng)激（CWS）在體內(nèi)發(fā)生，是對(duì)性信息素的響應(yīng)，性信息素會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壁成分的重組。CWS也會(huì)在多種應(yīng)激條件下出現(xiàn)，例如氧化應(yīng)激、極端pH值、DNA損傷劑、熱休克和低滲休克[ 3 ]。此外，一些化學(xué)物質(zhì)可以干擾細(xì)胞壁主要多糖（葡聚糖和幾丁質(zhì)）的合成或組裝，從而引發(fā)CWS。為了在體外誘導(dǎo)CWS，可以使用偶氮染料，例如剛果紅（CR）和鈣熒光白（CFW），溶菌酶（溶菌酶），殺菌性1,3-β-D-葡聚糖合酶抑制劑（環(huán)狀脂肽棘白菌素、酸性萜類化合物恩富馬芬菌素、糖脂類化合物帕普拉菌素），或幾丁質(zhì)合酶抑制劑（尼克霉素、多氧霉素）[ 9 , 10 ]。這些試劑會(huì)削弱細(xì)胞壁，導(dǎo)致真菌細(xì)胞裂解。

CFW被認(rèn)為能更特異性地結(jié)合幾丁質(zhì)，而CR主要結(jié)合α-1,3-和β-1,3-葡聚糖[ 11 , 12 ]。向活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞中添加CR或CFW會(huì)導(dǎo)致形態(tài)變化，包括酵母中母細(xì)胞和子細(xì)胞分離不完全，以及菌絲真菌中菌絲頂端的腫脹和裂解。這些偶氮染料被認(rèn)為能抑制新合成的幾丁質(zhì)、β-1,3-和β-1,6-葡聚糖鏈之間的鍵合，從而破壞細(xì)胞壁的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其弱化并最終裂解。然而，這些偶氮染料的確切作用機(jī)制仍不甚明了。值得注意的是，CR的作用不僅限于細(xì)胞壁，它還會(huì)影響煙曲霉的初級(jí)和次級(jí)代謝，表明其具有多效性[ 12 ]。

細(xì)胞壁完整性（CWI）通路在細(xì)胞壁水分流失（CWS）后被激活，導(dǎo)致主要細(xì)胞壁多糖——幾丁質(zhì)和α-葡聚糖的合成增強(qiáng)[ 13 ]。這些發(fā)現(xiàn)與觀察到的gfaA轉(zhuǎn)錄上調(diào)相一致，gfaA編碼谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶，該酶催化黑曲霉（A. niger）中CFW誘導(dǎo)的CWS后幾丁質(zhì)合成的第一步也是限速步驟[ 9 ]。在構(gòu)巢曲霉（ A. nidulans）中，中型CWI傳感器蛋白MtlA高度O-糖基化并定位于細(xì)胞表面[ 14 ]。MtlA的缺失會(huì)增加對(duì)CWI抑制劑的敏感性，并降低細(xì)胞壁α-葡聚糖和幾丁質(zhì)的含量。 CWI通路是一個(gè)多步驟磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，涉及通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAP2K）和轉(zhuǎn)錄因子RlmA誘導(dǎo)GTP酶RhoB和RhoD的表達(dá)。然而，黑曲霉復(fù)雜的防御系統(tǒng)在CWS條件下至少利用了三種轉(zhuǎn)錄因子——RlmA、MsnA和CrzA[ 15 ]。CWI通路在形態(tài)發(fā)生、毒力和抗真菌藥物敏感性中起著至關(guān)重要的作用[ 16 ]。然而，正如在酵母中觀察到的那樣，曲霉中還有兩條額外的通用應(yīng)激反應(yīng)通??路參與了對(duì)CWS的響應(yīng)。這兩條通路包括一條類似于酵母中Msn2p/Msn4p系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)通路（由曲霉中的MsnA同源物介導(dǎo)），以及分別由Crz1p和CrzA介導(dǎo)的鈣/鈣調(diào)磷酸酶通路[ 17 ]。這些通路促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)多種非生物脅迫，例如熱、冷和滲透脅迫，這些脅迫涉及胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)組成和膜脂譜的改變。值得注意的是，激活CWI信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子RlmA也影響脂質(zhì)代謝，某些MAP激酶不僅參與細(xì)胞對(duì)冷水汽沉積（CWS）的適應(yīng)，也參與對(duì)熱和滲透脅迫的適應(yīng)[ 17 ]。此外，膜不穩(wěn)定化合物，例如十二烷基硫酸鈉，已被證明可以誘導(dǎo)CWS。研究還揭示了響應(yīng)CWS、滲透脅迫、氧化脅迫和熱脅迫的信號(hào)通路之間的相互作用[ 18 , 19 ]。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了關(guān)于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜脂在響應(yīng)CWS中的作用的重要問(wèn)題。

真菌在生物技術(shù)領(lǐng)域被廣泛用于生產(chǎn)酶、有機(jī)酸和生物活性物質(zhì)[ 20 ]。這些產(chǎn)物大多通過(guò)細(xì)胞壁分泌。因此，研究表明，負(fù)責(zé)合成某些細(xì)胞壁多糖的基因發(fā)生突變可以提高生產(chǎn)真菌中有機(jī)酸和酶的產(chǎn)量。此外，曲霉屬真菌中的α-1,3-葡聚糖作為一種粘附因子，參與菌粒的形成[ 21 ]。

絲狀真菌通過(guò)調(diào)控細(xì)胞表面多糖的展示，控制其宏觀形態(tài)，例如形成菌球和松散菌落（絮狀物），進(jìn)而影響其生產(chǎn)力。此外，抑制細(xì)胞壁完整性（CWI）信號(hào)傳導(dǎo)是防治動(dòng)植物病原體的有效策略。真菌細(xì)胞壁是開發(fā)新型抗真菌藥物的理想靶點(diǎn)，因?yàn)槠浣M成與細(xì)菌或植物細(xì)胞壁以及動(dòng)物細(xì)胞膜的組成存在根本差異[ 22 ]。此外，酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁在組成和結(jié)構(gòu)上的差異可能具有潛在的益處。真菌對(duì)細(xì)胞壁完整性（CR）的耐受性已被用作不同生態(tài)位（例如昆蟲病原體、植物病原體、腐生菌和真菌寄生菌）的有效指標(biāo)[ 23 ]。因此，研究真菌對(duì)細(xì)胞壁完整性的響應(yīng)具有重要的基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究旨在調(diào)查在 CR 和 CFW 誘導(dǎo)的 CWS 條件下，黑曲霉CW 的膜脂、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和堿性多糖的組成。

2. 結(jié)果

2.1.偶氮染料對(duì)黑曲霉菌絲形態(tài)的影響

為了制定實(shí)驗(yàn)方案，我們選擇了偶氮染料的濃度（圖1）。在對(duì)照組中，培養(yǎng)12小時(shí)后，所有孢子均已萌發(fā)，并形成了長(zhǎng)而未分枝的芽管。16小時(shí)后，觀察到由活躍分枝的芽管組成的疏松菌落（絮狀物）。施用偶氮染料4小時(shí)后，與對(duì)照組相比，菌絲頂端生長(zhǎng)和菌絲體膨脹的形成均受到顯著抑制。因此，我們選擇了以下偶氮染料濃度：CR組為50 μg/mL，CFW組為75 μg/mL。值得注意的是，CR將菌絲體染成紅色；與CFW處理的菌絲體相比，CR處理組菌絲體上出現(xiàn)大量球狀菌絲頂端，且在菌落邊緣未觀察到菌絲頂端生長(zhǎng)。相反，CFW處理組菌絲膨脹顯著減少，且菌落邊緣僅有微弱的菌絲頂端生長(zhǎng)。同時(shí)，未觀察到菌絲頂端裂解現(xiàn)象。

來(lái)源：MDPI

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